Bercerita Mario dan Luigi baru-baru ini memulai bisnis pipa ledeng di Brooklyn, yang dicemooh mantan bos mereka Spike dan ketidaksetujuan ayah mereka. Setelah melihat kebocoran saluran air yang parah di berita, Mario dan Luigi pergi ke bawah tanah untuk memperbaikinya tapi tersedot ke dalam Pipa Warp dan terpisah. Mario mendarat di Kerajaan Jamur dipimpin oleh Putri Peach, sementara Luigi mendarat di Negeri Kegelapan, dipimpin raja jahat Koopa, Bowser. Bowser berusaha menikahi Peach dan akan menghancurkan Kerajaan Jamur menggunakan Super Star jika dia menolak. Dia memenjarakan Luigi untuk mengancam Mario, yang dia anggap sebagai persaingan cinta Peach. Mario bertemu Toad, yang membawanya bertemu Peach. Peach berencana untuk bersekutu dengan primata Kong agar membantu mengusir Bowser dan mengizinkan Mario dan Toad bepergian bersamanya. Peach juga memberitahu dia berakhir di Kerajaan Jamur ketika dia masih bayi, saat Kodok membawanya dan akhirnya menjadi pemimpin mereka. Di Kerajaan Hutan, Raja Cranky Kong setuju untuk membantu dengan syarat Mario mengalahkan putranya, Donkey Kong, dalam perkelahian. Terlepas dari kekuatan Donkey Kong yang luar biasa, Mario jauh lebih cepat dan mampu mengalahkannya menggunakan kostum Kucing.